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    本發明係關於原蛋白(proprotein)轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)抗體或其抗原結合片段、包含該等PCSK9抗體或抗原結合片段之組合物，及使用其治療高脂血症或高膽固醇血症之方法。
    公开号:TW201323444A
    申请号:TW101131954
    申请日:2012-08-31
    公开日:2013-06-16
    发明作者:Julian Davies；Barrett Allan；Ryan James Darling
    申请人:Lilly Co Eli；
    IPC主号:C07K16-00
    专利说明:
    PCSK9抗體及其用途
    本發明係在醫藥領域內。特定言之，本發明係關於原蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)抗體、包含該等PCSK9抗體之組合物及使用PCSK9抗體治療高脂質血症或高膽固醇血症之方法。
    原蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)為主要在肝中產生之分泌性絲胺酸蛋白酶，其調節低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)之血漿濃度。分泌性PCSK9結合於位於肝細胞表面上之LDL受體(LDLR)且使其內化。LDLR藉由結合LDL顆粒且將其輸送至溶酶體進行降解而自血漿清除LDL-C。一旦遞送LDL顆粒進行降解，則LDLR再循環至肝細胞表面以自血漿結合且清除其他LDL-C。PCSK9藉由引導內化LDLR進行降解而不是再循環至細胞表面來調節血漿LDL-C，因此降低LDL-C清除。體內PCSK9表現不足或過度表現之齧齒動物的研究現已證實，PCSK9藉由調節LDLR含量來控制循環LDL含量。循環PCSK9參與肝LDLR之降解的觀察結果表明，PCSK9之抗體中和為降低LDL-C之可行治療方法。此外，已報導士他汀藥物(降低LDL-C現行照護標準)可實際上提高PCSK9之表現及血清含量。因此，PCSK9抗體亦有可能以與士他汀治療協同之方式來降低LDL-C。
    PCSK9抗體及其對降低血漿LDL-C之作用在所屬領域中為已知的。例如，US 2009/0246192、US 2009/0142352、US 2010/0166768及WO 2010/029513揭示該等PCSK9抗體及其用途。然而，迄今，靶向PCSK9之抗體尚未核准用於治療用途。因此仍需要替代PCSK9抗體。特定而言，仍需要以高效能降低LDL-C之替代PCSK9抗體。更特定而言，仍需要以高效能降低LDL-C且提供持續作用時間(例如持續抑制LDL-C含量)的替代PCSK9抗體。該等抗體亦可較佳具有便於研發、製造或調配的良好物理化學性質。
    本發明提供一種抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(HCVR)及輕鏈可變區(LCVR)，其中HCVR包含互補決定區(CDR)HCDR1、HCDR2及HCDR3且LCVR包含CDR LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中HCDR1之胺基酸序列由SEQ ID NO：1列出，HCDR2之胺基酸序列由SEQ ID NO：2列出，HCDR3之胺基酸序列由SEQ ID NO：3列出，LCDR1之胺基酸序列由SEQ ID NO：4列出，LCDR2之胺基酸序列由SEQ ID NO：5列出，且LCDR3之胺基酸序列由SEQ ID NO：6列出，其中該抗體或其抗原結合片段結合於人類PCSK9。在一實施例中，本發明提供一種抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(HCVR)及輕鏈可變區(LCVR)，其中HCVR之胺基酸序列由SEQ ID NO：7列出且LCVR之胺基酸序列由SEQ ID NO：8列出，其中該抗體或其抗原結合片段結合於人類PCSK9。在另一實施例中，本發明提供一種抗體或其抗原結合片段，其包含兩個重鏈可變區(HCVR)及兩個輕鏈可變區，其中各HCVR之胺基酸序列由SEQ ID NO：7列出且各LCVR之胺基酸序列由SEQ ID NO：8列出。
    在另一特定實施例中，本發明提供一種抗體或一種其抗原結合片段，其包含重鏈(HC)及輕鏈(LC)，其中HC之胺基酸序列由SEQ ID NO：9列出且LC之胺基酸序列由SEQ ID NO：10列出。在一更特定實施例中，本發明提供一種包含兩個重鏈(HC)及兩個輕鏈(LC)之抗體，其中各HC之胺基酸序列由SEQ ID NO：9列出且各LC之胺基酸序列由SEQ ID NO：10列出。在一最特定之實施例中，本發明提供由兩個HC及兩個LC組成之抗體，其中各HC之胺基酸序列由SEQ ID NO：9列出且各LC之胺基酸序列由SEQ ID NO：10列出。
    本發明進一步提供醫藥組合物，其包含本發明之抗體或抗原結合片段及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。更特定而言，本發明之醫藥組合物進一步包含一或多種其他治療劑。
    此外，本發明提供治療高脂質血症或高膽固醇血症之方法，其包含向有需要之患者投與有效量之本發明之抗體或抗原結合片段。本發明亦提供用於治療之本發明之抗體或其抗原結合片段。更特定而言，本發明提供用於治療高脂質血症或高膽固醇血症之本發明之抗體或其抗原結合片段。此外，本發明提供本發明之抗體或其抗原結合片段的用途，其用於製造供治療高脂質血症或高膽固醇血症之藥劑。
    本發明亦關於編碼本發明之抗體或抗原結合片段的核酸分子及表現載體。此外，本發明提供一種根據如下製程而製備的抗體，其中該製程包含：(a)培養包含編碼由SEQ ID NO：9列出之多肽序列之第一聚核苷酸序列及編碼由SEQ ID NO：10列出之第二多肽序列之第二聚核苷酸序列的宿主細胞，培養條件使得該等多肽序列得到表現；及(b)自該宿主細胞回收包含重鏈及輕鏈之抗體，其中該重鏈之多肽序列由SEQ ID NO：9列出且該輕鏈之多肽序列由SEQ ID NO：10列出。更特定而言，藉由前述製程製備之抗體包含兩個重鏈及兩個輕鏈，其中各重鏈之多肽序列由SEQ ID NO：9列出且各輕鏈之多肽序列由SEQ ID NO：10列出。
    全長抗體為包含藉由雙硫鍵相互連接之2個重(H)鏈及2個輕(L)鏈的免疫球蛋白分子。各鏈之胺基末端部分包括具有約100-110個胺基酸之可變區，其主要負責經由其中含有之互補決定區(CDR)進行抗原識別。各鏈之羧基末端部分界定主要負責效應功能之恆定區。輕鏈分為κ或λ，其各自藉由此項技術中已知之特定恆定區來表徵。重鏈分為γ、μ、α、δ或ε，且將抗體之同型分別定義為IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。IgG抗體可進一步分成例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4之子類。各重鏈類型亦藉由具有此項技術中熟知之序列的特定恆定區來表徵。如本文所用之「抗原結合片段」係指結合於人類PCSK9之Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段及單鏈Fv片段。如本文所用之術語「結合於人類PCSK9」係指與在由SEQ ID NO：14之胺基酸序列列出之人類PCSK9上的抗原決定基的相互作用。如本文所用之術語「抗原決定基」係指在由本發明之抗體或抗原結合片段識別之抗原上的離散三維位點。
    CDR散置更為保守之區域，稱為構架區(「FR」)。各輕鏈可變區(LCVR)及重鏈可變區(HCVR)包含3個CDR及4個FR，自胺基末端至羧基末端按下列順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。輕鏈之3個CDR係稱為「LCDR1、LCDR2及LCDR3」且重鏈之3個CDR係稱為「HCDR1、HCDR2及HCDR3」。CDR含有之大部分殘基與抗原形成特定相互作用。CDR胺基酸殘基在本發明之抗體或抗原結合片段的LCVR及HCVR區域內的編號及定位可根據熟知之Kabat編號規定(LCDR1-3、HCDR2-3)或根據Kabat加Chothia(HCDR1)來確定。
    製備及純化抗體及抗原結合片段之方法在此項技術中為熟知的且可見於例如Harlow及Lane(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York，第5-8章及第15章中。例如，小鼠可經人類PCSK9或其片段免疫，且所得抗體隨後可經回收、純化，且胺基酸序列使用此項技術中所熟知之習用方法來確定。抗原結合片段亦可藉由習用方法加以製備。本發明之抗體或抗原結合片段經工程設計以含有圍繞源自非人類抗體之CDR的一或多個人類構架區。人類構架生殖系序列可自ImMunoGeneTics(IMGT)經由其網站http：//imgt.cines.fr而獲得，或自Marie-Paule Lefranc及Gerard Lefranc之The Immunoglobulin Facts Book,Academic Press,2001,ISBN 012441351而獲得。用於本發明之抗體或抗原結合片段的特定生殖系輕鏈構架包括A3及O2。用於本發明之抗體或抗原結合片段的特定生殖系重鏈構架區包括VH3-21及VH3-23。
    本發明之工程設計抗體或抗原結合片段可使用已知方法來製備及純化。例如，編碼重鏈(例如由SEQ ID NO：9列出之胺基酸序列)及輕鏈(例如由SEQ ID NO：10列出之胺基酸序列)的cDNA序列可經選殖及工程設計成GS(麩醯胺酸合成酶)表現載體。工程設計免疫球蛋白表現載體可隨後在CHO細胞中經穩定轉染。如熟習此項技術者應瞭解，哺乳動物之抗體表現通常在Fc區域中之高度保守N糖基化位點將引起糖基化。驗證用於表現特異性地結合於人類PCSK9之抗體的穩定純系。陽性純系可在無血清培養基中擴增以在生物反應器中產生抗體。抗體已分泌至其中的培養基可藉由習用技術來純化。例如，培養基宜施用於A蛋白或G蛋白瓊脂糖FF管柱，該A蛋白或G蛋白瓊脂糖FF管柱已使用諸如磷酸鹽緩衝鹽水之相容緩衝液進行平衡。洗滌管柱以移除非特異性結合組分。結合抗體例如藉由pH梯度來溶離且抗體溶離份諸如藉由SDS-PAGE來偵測，且隨後經混合。抗體可使用常見技術進行濃縮及/或滅菌過濾。可溶性聚集體及多聚體可藉由包括尺寸排阻、疏水性相互作用、離子交換或羥基磷灰石層析法之常見技術而有效移除。產物可例如在-70℃下立刻冷凍，或可經凍乾。
    本發明之抗體為單株抗體。如本文所用之「單株抗體」或「mAb」係指自包括例如任何真核、原核或噬菌體純系之單複本或純系而不是藉由其製備方法得到的抗體。單株抗體及其抗原結合片段可例如藉由融合瘤技術、重組技術、噬菌體呈現技術、合成技術(例如CDR移植)或此項技術中已知之該等技術或其他技術的組合來製備。
    在本發明之另一實施例中，以分離形式提供抗體或其抗原結合片段或編碼該抗體或其抗原結合片段之核酸。如本文所用，術語「分離」係指蛋白質、肽或核酸不含或實質上不含細胞環境中可見之其他巨分子物質。如本文所用，「實質上不含」意謂相關蛋白質、肽或核酸包含80%以上、較佳90%以上且更佳95%以上(以莫耳計)存在的巨分子物質。
    本發明之抗體或抗原結合片段可用於治療患者。術語「治療」係指減緩、中斷、遏止、減輕、停止、降低或逆轉現存症狀、病症、病狀或疾病之發展或嚴重性。如本文所用，「患者」係指人類或非人類哺乳動物，但較佳係指人類。如本文所用，術語「有效量」係指本發明之抗體或抗原結合片段以單劑量或多劑量向患者投與時在所治療患者中提供所要效果的量或劑量。有效量可輕易地由熟習此技術之主治診斷醫師考慮許多因素決定：諸如哺乳動物之物種；其大小、年齡、及總體健康狀況；所涉及之特定疾病；疾病之程度或嚴重性；個體患者之反應；所投與之特定抗體；投與方式；所投與製劑之生物可用性特徵；所選劑量方案；及任何伴隨藥療法之使用。
    本發明之抗體或抗原結合片段或包含該等抗體或抗原結合片段之醫藥組合物可藉由非經腸途徑(例如皮下、靜脈內、腹膜內、肌內或經皮)投與。本發明之醫藥組合物可由此技術中熟知之方法製備(例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版(1995),A.Gennaro等人，Mack Publishing Co.)且包含本文中所揭示之抗體或其抗原結合片段，及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。例如，本發明之抗體或抗原結合片段可與諸如檸檬酸鈉、檸檬酸、聚山梨醇酯80及蔗糖一起調配，且所得組合物可隨後經凍乾及儲存於2℃-8℃。經凍乾之組合物隨後可在投與前使用無菌注射用水復原。
    以下實例進一步說明本發明，然而，應瞭解該等實例以說明性而非限制性方式陳述，且可藉由一般技術者進行多種改變。 實例1工程設計之PCSK9抗體
    鼠類宿主經包含人類PCSK9(SEQ ID NO：17)之C端截短片段的肽免疫且結合PCSK9之IgG抗體使用標準方法分離及選殖。經分離之鼠類Fab的CDR藉由突變誘發進行隨機化且所得抗體針對與人類PCSK9之親和性進行篩檢。組合增強親和性之突變且將最佳化CDR分別工程設計於人類VH3-21及A3重鏈及輕鏈構架上。為了進一步使人類化抗體之生物物理性質最佳化，在CDR序列內進行芳族及疏水性胺基酸之標靶替換。隨機化CDR庫亦針對其他增強親和性之突變進行篩檢。有益CDR突變經隨機組合及表現，且所得抗體針對與人類PCSK9之親和性進行篩檢。獲得具有以下胺基酸序列之全長人類化及最佳化PCSK9抗體：
    分別編碼SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10之重鏈及輕鏈胺基酸序列的對應cDNA序列為如下： 實例2工程設計之PCSK9抗體之表現
    實例1之工程設計之PCSK9抗體可表現於穩定轉染CHO細胞株中。使用含有SEQ ID NO：11(編碼SEQ ID NO：9之重鏈胺基酸序列)及SEQ ID NO：12(編碼SEQ ID NO：10之輕鏈胺基酸序列)之cDNA的麩醯胺酸合成酶(GS)表現載體藉由電穿孔來轉染中國倉鼠細胞株，CHOK1SV(Lonza Biologics PLC,Slough,United Kingdom)。表現載體編碼SV早期(猿猴病毒40E)啟動子及GS之基因。GS之表現容許生物化學合成麩醯胺酸，一種為CHOK1SV細胞所需之胺基酸。轉染後，細胞使用50 μM L-甲硫胺酸磺醯亞胺(MSX)進行群體選擇(bulk selection)。藉由MSX對GS之抑制用以提高選擇之嚴格性。表現載體cDNA整合至宿主細胞基因組之轉錄活性區域中的細胞可針對CHOK1SV野生型細胞進行選擇，該等CHOK1SV野生型細胞表現GS之內源含量。大量培養物使用螢光活性細胞分類(FACS)技術進行單細胞選殖且選殖細胞株經擴增且針對實例1之工程設計之PCSK9抗體的表現進行篩檢。 實例3抗原決定基結合
    鼠類IgG之結合PCSK9之抗原決定基(實例1之工程設計之PCSK9抗體自其得到)藉由抗原決定基萃取及氫/氘交換質譜法來確定且縮小至人類PCSK9催化結構域之線性胺基酸序列160-181內的區域(胺基酸編號基於全長人類PCSK9序列，其包括二十八胺基酸信號肽)。在人類PCSK9之催化結構域中實例1之工程設計抗體與該抗原決定基之相互作用藉由評估其與對應於殘基160-181(表1)之合成肽的結合而確認。實例1之工程設計抗體結合肽160-181之親和性高於完整人類PCSK9，不同的是其由較快締合速率(kon)驅動。解離速率(koff)係在完整PCSK9的2倍以內，其表明相互作用(在結合已發生後)之強度為類似的。此外，資料表明幾乎所有結合決定子係包含於PCSK9之該線性區域內。實例1之工程設計抗體與肽166-181之結合顯著弱於與肽160-181之結合，顯示在160-165區域內之胺基酸(或多個胺基酸)的作用。實例1之工程設計抗體與肽163-174之結合顯著強於與166-181之結合，亦表明殘基163-165之貢獻。
    實例4結合動力學及親和性
    使用如此項技術中熟知之表面電漿子共振(SPR)分析法來評估測試PCSK9抗體與人類、食蟹獼猴、小鼠、大鼠及兔PCSK9之結合動力學及親和性。在生理緩衝條件(離子強度及pH值)及溫度(37℃)下，實例1之工程設計抗體以1.2×105 M-1s-1的平均締合速率(kon)及1.2×10-3 s-1之平均解離速率(koff)結合於人類PCSK9。人類PCSK9與實例1之工程設計抗體結合的平均KD確定為約11 nM。實例1之工程設計抗體以1.1×105 M-1s-1之平均締合速率(kon)及2.5×10-3 s-1之平均解離速率(koff)結合於食蟹獼猴PCSK9，產生約25 nM之獼猴PCSK9結合KD。以下表2顯示使用小鼠、大鼠及兔PCSK9由實例1之工程設計之PCSK9抗體獲得之其他結果的概述。該等資料指示實例1之工程設計之PCSK9抗體在pH值、離子強度及溫度之生理條件下以奈莫耳親和性結合於人類及食蟹獼猴兩者之PCSK9。
    實例5對PCSK9與LDL受體結合之抑制
    PCSK9藉由降低肝之LDLR含量且藉此降低肝細胞吸收之LDL來調節血漿LDL-C。PCSK9之催化結構域為與LDLR結合之位點。因此，識別PCSK9之催化結構域的抗體可期望抑制PCSK9與LDLR之結合。
    使用AlphaLISA®格式來確定測試PCSK9抗體對PCSK9與LDL受體結合的作用。分析中所使用之重組全長PCSK9表現為人胚腎(HEK)293穩定細胞株中之C端標記HIS之蛋白質(Qian等人，J.Lipid Res.48：1488-1498,2007)。重組LDL受體細胞外結構域表現為經短暫性轉染之HEK 293E細胞中之C端標記FLAG之蛋白質(Qian等人，J.Lipid Res.48：1488-1498,2007)。與人類PCSK9之C端結構域結合的鼠類抗PCSK9 Mab表現於HEK293細胞中且在G蛋白親和管柱上接著在Superdex 200上純化。單株ANTI-FLAG® BioM2抗體(Sigma)為經純化之小鼠IgG1單株抗體，其藉由醯肼鍵聯共價連接於生物素。ANTI-FLAG BioM2將在FLAG融合蛋白質之N端、Met-N端或C端處識別FLAG序列。ANTI-FLAG BioM2可藉由抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素結合物來偵測。單株ANTI-FLAG BioM2-生物素在50%甘油、10 mM磷酸鈉、pH 7.25、含0.02%疊氮化鈉之150 mM NaCl中供給，且儲存於-20℃下。
    AlphaLISA®實驗係在384孔白色微孔板(proxiplates)(Perkin Elmer)中使用25 mM之HEPES；pH 7.5、100 mM NaCl、2.5 mM CaCl2、0.5% TX-100、0.1%酪蛋白、1 mg/ml Dextran-500及0.05% Proclin-300作為緩衝液進行。分析係使用AlphaLISA®抗生蛋白鏈菌素供者微珠(Perkin Elmer)及結合鼠類抗PCSK9 Mab之AlphaLISA®受者微珠。當該等微珠經由結合搭配物PCSK9及LDLR之相互作用接近時，單線態氧自供者微珠轉移至受者微珠。在680 nm雷射激發時，單線態氧激發受者微珠發射光。受者微珠藉由使用NaBH3CN(Sigma)之還原胺化連接至鼠類抗PCSK9 Mab且儲存於4℃。鼠類抗PCSK9 Mab結合之受者微珠(22 μg/ml)預載2.22 nM PCSK9歷經一小時。供者微珠(44 μg/ml)預載5.55 nM ANTI-FLAG® BioM2及2.22 nM標記FLAG之LDLR歷經一小時。在預載之後，使用全自動Multimek(Beckman)將2 μl之測試PCSK9抗體或對照IgG添加至含有9 μl之各微珠混合物的微孔板中(PCSK9及LDLR之最終濃度=1 nM)，且容許在室溫結合過夜。AlphaLISA®信號(每秒計數)係在Envision Turbo(Perkin Elmer)上測量。使用AlphaLISA®分析之所有實驗均在低光條件下進行。
    遵循實質上如上所述之程序，AlphaLISA®分析中人類PCSK9與LDLR之結合隨PCSK9濃度而增加。添加實例1之工程化PCSK9抗體(測試PCSK9抗體)造成PCSK9與LDLR結合之濃度相關性及完全的抑制，平均IC50為約90 pM。對照IgG4在分析中無作用。該分析之結果顯示實例1之工程化PCSK9抗體抑制人類PCSK9與LDLR之結合。 實例6對HepG2細胞上PCSK9功能之抑制
    為了確定測試PCSK9抗體對肝細胞上LDLR之密度的作用，人類HepG2細胞在塗佈聚-D-離胺酸之T75燒瓶中培養。在24小時之後，細胞以5,000個細胞/每孔接種於在塗佈聚-D-離胺酸之96孔黑色板(Becton-Dickinson)中含有5%(v/v)人類脂蛋白空乏血清(LPDS；Intracel)之100 μl DMEM/F-12(3：1)培養基中。在含LPDS之培養基中隔夜培育後，細胞使用69 nM(5 μg/mL)之C端標記HIS之重組人類PCSK9及2.6 nM至1333 nM範圍內之濃度的測試PCSK9抗體或IgG4對照抗體培育2小時。所有培育均在37℃下進行。LDLR含量使用經Zenon® Alexa Fluor® 488小鼠IgG2b標記套組(Invitrogen)螢光標記之LDLR抗體(Progen)來監測。細胞與偵測抗體一起在室溫下培育90分鐘且隨後使用不含福馬林之固定劑(較佳；ANATECH,Ltd)固定10分鐘，隨後在0.01%之Triton X-100中進行滲透。細胞用10 μg/ml之碘化丙錠(Invitrogen)染色以確定總細胞數目。LDLR信號使用Acumen ExPlorerTM雷射掃描螢光微板細胞計螢光檢測器(TTP LabTech)來定量。
    遵循實質上如上所述之程序，人類PCSK9引起HepG2細胞上LDLR之濃度依賴性降低，EC50為18 nM。實例1之工程設計PCSK9抗體(測試PCSK9抗體)抑制HepG2細胞上LDLR的PCSK9誘導之抑制，IC50為104 nM。人類IgG4對照在多達1333 nM之濃度下相對為非活性的。該等資料顯示實例1之工程設計PCSK9抗體抑制PCSK9介導之LDLR降解。 實例7對LDL攝取之PCSK9誘導之降低的抑制
    為了確定測試PCSK9抗體對LDL攝取之作用，HepG2細胞以5,000個細胞/孔接種於經聚-D-離胺酸塗佈之96孔黑色板上補充有5%人類LPDS之100 μl的DMEM/F-12(3：1)培養基中且在37℃下5%之CO2的氛圍中培育18小時。人類PCSK9(69 nM)添加至含或不含2.6 nM至1333 nM範圍內之濃度的PCSK9測試抗體或人類IgG4對照的細胞中且在37℃下與細胞一起預培育2小時。在添加100奈克/孔之經螢光標記之LDL(BODIPY-LDL,Invitrogen)之後，細胞隨後在37℃下培育4小時。細胞在室溫下在不含福馬林之固定劑(較佳；ANATECH,Ltd.)中固定20分鐘。在使用PBS洗滌細胞兩次之後，細胞在室溫下使用含有0.01%之Triton X-100的PBS緩衝液滲透15分鐘且使用10 μg/mL碘化丙錠進行染色以確定總細胞數目。LDL攝取使用Acumen ExplorerTM雷射掃描螢光微板細胞計來確定且表示為螢光細胞相對於總細胞之百分比。對測試PCSK9抗體或對照IgG之反應表示為PCSK9抑制百分比，亦即，回到相對於在僅存在PCSK9下之基線LDL-C攝取在不存在PCSK9下為最大LDL攝取的百分比。亦計算抑制LDL攝取之PCSK9誘導之降低的對應IC50值。
    遵循實質上如上所述之程序，人類PCSK9引起HepG2細胞中LDL攝取之濃度相關性降低，EC50為32 nM。實例1之工程設計之PCSK9抗體逆轉PCSK9誘導之抑制，反映為LDL攝取增加，而對照IgG不逆轉抑制。特定而言，實例1之工程設計之PCSK9抗體顯示84%之PCSK9平均最大抑制百分比及194 nM之平均IC50。該等資料顯示實例1之工程設計之PCSK9抗體抑制LDL攝取之PCSK9誘導的降低。 實例8活體內功效
    為了確定測試PCSK9抗體之活體內藥物動力學(PK)及/或藥效學(PD)作用，可向正常食蟹獼猴投與測試抗體且隨後確定多種PK及/或PD參數。例如，測試PCSK9抗體可經由靜脈內或皮下方式向健康、未處理食蟹獼猴投與且測試抗體之血清濃度可隨後藉由使用人類IgG三明治ELISA來量測。在抗體投與後多個時間點量取之血清濃度可用於確定測試抗體之多個PK參數，包括T1/2、Cmax、AUC及血漿清除率(CL)。同樣，測試PCSK9抗體可經由靜脈內或皮下方式向健康、未處理食蟹獼猴投與且LDL-C之血清濃度可藉由自動分析儀(Direct LDL-C Plus，第2代，Roche Diagnostics)量測。
    遵循實質上如上所述之程序，在1 mg/kg、5 mg/kg或15 mg/kg之單次劑量靜脈內投與後及在5 mg/kg之單次皮下劑量後，在健康食蟹獼猴中評估實例1之工程設計之PCSK9抗體的藥物動力學。由該等研究來確定之藥物動力學參數提供於以下表3中。
    在兩個獨立研究中投與實例1之工程設計之PCSK9抗體後量測血清LDL。在兩個研究中，LDL-C抑制之證據不遲於投與實例1之工程設計之PCSK9抗體後24小時即顯而易見。在以5 mg/kg靜脈內(i.v.)投與實例1之抗體之後，觀測到最大平均LDL-C降低60%(研究1)及25%(研究2)。在5 mg/kg i.v.時，平均LDL-C抑制維持約8週(研究1)及2週(研究2)。在研究2中，存在劑量(1 mg/kg至15 mg/kg)對LDL-C抑制之量值(25%至35%)的適度作用。劑量對持續時間之LDL-C抑制之作用更為明顯。當皮下投與(5 mg/kg)時，實例1之工程設計抗體在將LDL-C含量抑制至類似於靜脈內給藥後所觀測到者之量值方面為有效的。在投與任何劑量之實例1之工程設計抗體後，對血清高密度脂蛋白膽固醇無影響。 實例9工程設計PCSK9抗體之物理化學性質
    亦發現實例1之工程設計之PCSK9抗體具有良好的溶解性、化學穩定性及物理穩定性。 A.溶解性
    需要足夠高之溶解度以使給藥便利。例如，藉由1.0 mL注射至100 kg之患者中而投與的1 mg/kg之劑量將需要100 mg/mL之溶解性。此外，使抗體維持在高濃度下無高分子量(HMW)聚集的單體狀態中亦為合乎需要的。為了測定測試抗體之溶解性，抗體可透析至以下物質中：(1)10 mM檸檬酸鹽，pH6；(2)10 mM檸檬酸鹽，pH6，150 mM NaCl；及(3)磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)，pH7.4。回收之透析液可隨後藉由分析尺寸排阻層析法(SEC)分析以量測HMW百分比。測試抗體可隨後在約25℃下4 mL離心濃縮機中進行濃縮直至達成溶解度極限或達成濃縮器之空隙容積。若達成空隙容積，則濃度以來報導。濃縮抗體可隨後藉由SEC分析以量測HMW百分比。為了確定濃縮時%HMW之任何增加是否為可逆的，濃縮樣品可稀釋至1 mg/mL且藉由SEC分析。
    遵循實質上如上所述之程序，實例1之工程設計之PCSK9抗體在所有測試條件下展示大於128 mg/mL之溶解度。此外，僅低含量之HMW以高濃度存在。
    B.化學穩定性
    化學穩定性有助於研發具有足夠存放期之藥物調配物。為了評估測試抗體之化學穩定性，抗體可在於pH4、pH5、pH6或pH7緩衝之10 mM檸檬酸鹽中以1 mg/mL之濃度調配。調配樣品隨後在加速降解研究中於4℃、25℃及40℃培育4週。抗體之裝藥概況的變化(反映化學變化)可使用毛細管等電聚焦(cIEF)根據標準程序來評估。遵循實質上如上所述之程序，實例1之工程設計抗體之化學穩定性分析提供以下結果。
    結果顯示，在25℃下儲存4週之後，當在pH6(抗體調配物中所用之常用pH值)下調配時主峰%僅降低4.1個百分點，表明實例1之工程設計之PCSK9抗體具有足以有助於研發具有充足存放期之溶液調配物的化學穩定性。此外，抗體在pH5及更小之程度pH7下亦展示良好的化學穩定性，表明抗體具有允許在一定範圍之pH值單位內調配的穩定性特徵。 C.物理穩定性
    為了評估測試抗體之物理穩定性，抗體可在於pH4、pH5、pH6或pH7緩衝之10 mM檸檬酸鹽(或10 mM Tris，pH 8)中以1 mg/mL之蛋白質濃度調配。樣品隨後在加速降解研究中於4℃、25℃及40℃下培育4週。在培育之後，使用尺寸排阻層析法(SEC)評估物理穩定性，該尺寸排阻層析法自聚集高分子量(HMW)抗體分離所要之單體抗體。
    遵循實質上如上所述之程序，表6概述實例1之工程設計之PCSK9抗體之物理穩定性分析的結果。資料顯示，在pH5、pH6及pH7下，HMW在25℃或40℃下經過4週之變化低於1%，表明該抗體具有良好的物理穩定性且對自締合及聚集具有抗性。
    序列
    HCDR1(SEQ ID NO：1)：GFPFSKLGMV
    HCDR2(SEQ ID NO：2)：TISSGGGYTYYPDSVKG
    HCDR3(SEQ ID NO：3)：EGISFQGGTYTYVMDY
    LCDR1(SEQ ID NO：4)：RSSKSLLHRNGITYSY
    LCDR2(SEQ ID NO：5)：QLSNLAS
    LCDR3(SEQ ID NO：6)：YQNLELPLT
    HCVR(SEQ ID NO：7)：EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFPFSKLGMVWVRQAPGKGLEWVSTISSGGGYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGISFQGGTYTYVMDYWGQGTLVTVSS
    LCVR(SEQ ID NO：8)：DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHRNGITYSYWYLQKPGQSPQLLIYQLSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCYQNLELPLTFGQGTKVEIK
    HC(SEQ ID NO：9)：EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFPFSKLGMVWVRQAPGKGLEWVSTISSGGGYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGISFQGGTYTYVMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
    LC(SEQ ID NO：10)：DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHRNGITYSYWYLQKPGQSPQLLIYQLSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCYQNLELPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
    HC cDNA(SEQ ID NO：11)：GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTAAAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCCCGTTCAGTAAGCTCGGCATGGTTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAACCATTAGTAGTGGTGGTGGTTACACATACTATCCAGACAGTGTGAAGGGGCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAGAGAAGGAATTAGCTTTCAGGGTGGCACCTACACTTATGTTATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAAAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTTGA
    LC cDNA(SEQ ID NO：12)GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCTTACATCGTAATGGCATCACTTATTCGTATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATCAGCTGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCAGGCACTGATTTCACACTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGAGTTTATTACTGCTATCAAAATCTAGAACTTCCGCTCACGTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAACGGACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGCTAA
    hPCSK9(SEQ ID NO：13)：RAQEDEDGDYEELVLALRSEEDGLAEAPEHGTTATFHRCAKDPWRLPGTYVVVLKEETHLSQSERTARRLQAQAARRGYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELALKLPHVDYIEEDSSVFAQSIPWNLERITPPRYRADEYQPPDGGSLVEVYLLDTSIQSDHREIEGRVMVTDFENVPEEDGTRFHRQASKCDSHGTHLAGVVSGRDAGVAKGASMRSLRVLNCQGKGTVSGTLIGLEFIRKSQLVQPVGPLVVLLPLAGGYSRVLNAACQRLARAGVVLVTAAGNFRDDACLYSPASAPEVITVGATNAQDQPVTLGTLGTNFGRCVDLFAPGEDIIGASSDCSTCFVSQSGTSQAAAHVAGIAAMMLSAEPELTLAELRQRLIHFSAKDVINEAWFPEDQRVLTPNLVAALPPSTHGAGWQLFCRTVWSAHSGPTRMATAVARCAPDEELLSCSSFSRSGKRRGERMEAQGGKLVCRAHNAFGGEGVYAIARCCLLPQANCSVHTAPPAEASMGTRVHCHQQGHVLTGCSSHWEVEDLGTHKPPVLRPRGQPNQCVGHREASIHASCCHAPGLECKVKEHGIPAPQEQVTVACEEGWTLTGCSALPGTSHVLGAYAVDNTCVVRSRDVSTTGSTSEGAVTAVAICCRSRHLAQASQELQDVHHHHHH
    hPCSK9 160-181(SEQ ID NO：14)：RITPPRYRADEYQPPDGGSLVE
    hPCSK9 166-181(SEQ ID NO：15)：YRADEYQPPDGGSLVE
    hPCSK9 163-174(SEQ ID NO：16)：PPRYRADEYQPP
    C端截短hPCSK9(SEQ ID NO：17)：QEDEDGDYEELVLALRSEEDGLAEAPEHGTTATFHRCAKDPWRLPGTYVVVLKEETHLSQSERTARRLQAQAARRGYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELALKLPHVDYIEEDSSVFAQSIPWNLERITPPRYRADEYQPPDGGSLVEVYLLDTSIQSDHREIEGRVMVTDFENVPEEDGTRFHRQASKCDSHGTHLAGVVSGRDAGVAKGASMRSLRVLNCQGKGTVSGTLIGLEFIRKSQLVQPVGPLVVLLPLAGGYSRVLNAACQRLARAGVVLVTAAGNFRDDACLYSPASAPEVITVGATNAQDQPVTLGTLGTNFGRCVDLFAPGEDIIGASSDCSTCFVSQSGTSQAAAHVAGIAAMMLSAEPEL
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    <220>
    <223> 合成
    <400> 17
    权利要求:
    Claims (11)
    [1] 一種抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(HCVR)及輕鏈可變區(LCVR)，其中該HCVR包含互補決定區(CDR)HCDR1、HCDR2及HCDR3且該LCVR包含互補決定區LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中HCDR1之胺基酸序列由SEQ ID NO：1列出，HCDR2之胺基酸序列由SEQ ID NO：2列出，HCDR3之胺基酸序列由SEQ ID NO：3列出，LCDR1之胺基酸序列由SEQ ID NO：4列出，LCDR2之胺基酸序列由SEQ ID NO：5列出，且LCDR3之胺基酸序列由SEQ ID NO：6列出，其中該抗體或其抗原結合片段結合於人類PCSK9。
    [2] 如請求項1之抗體或抗原結合片段，其包含重鏈可變區(HCVR)及輕鏈可變區(LCVR)，其中該HCVR之胺基酸序列由SEQ ID NO：7列出且該LCVR之胺基酸序列由SEQ ID NO：8列出。
    [3] 如請求項2之抗體或抗原結合片段，其包含兩個HCVR及兩個LCVR，其中各HCVR之胺基酸序列由SEQ ID NO：7列出，且各LCVR之胺基酸序列由SEQ ID NO：8列出。
    [4] 如請求項1至3中任一項之抗體或抗原結合片段，其包含重鏈(HC)及輕鏈(LC)，其中該HC之胺基酸序列由SEQ ID NO：9列出，且該LC之胺基酸序列由SEQ ID NO：10列出。
    [5] 如請求項4之抗體或抗原結合片段，其包含兩個重鏈(HC)及兩個輕鏈(LC)，其中各HC之胺基酸序列由SEQ ID NO：9列出，且各LC之胺基酸序列由SEQ ID NO：10列出。
    [6] 如請求項5之抗體或抗原結合片段，其包含兩個重鏈(HC)及兩個輕鏈(LC)，其中各HC之胺基酸序列由SEQ ID NO：9列出，且各LC之胺基酸序列由SEQ ID NO：10列出。
    [7] 一種由兩個重鏈及兩個輕鏈組成之抗體，其中各重鏈之胺基酸序列由SEQ ID NO：9列出，且各輕鏈之胺基酸序列由SEQ ID NO：10列出。
    [8] 如請求項1至3及請求項7中任一項之抗體或抗原結合片段，其用於治療。
    [9] 如請求項1至3及請求項7中任一項之抗體或抗原結合片段，其用於治療高脂血症或高膽固醇血症。
    [10] 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至7中任一項之抗體或抗原結合片段及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
    [11] 一種如請求項1至7中任一項之抗體或抗原結合片段之用途，其用於製造供治療高脂血症或高膽固醇血症的藥物。
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    法律状态:
    2019-03-11| MM4A| Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees|
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    US201161535625P| true| 2011-09-16|2011-09-16||
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